Лигирование ДНК — фундаментальный метод молекулярной биологии, который включает в себя соединение фрагментов ДНК для создания рекомбинантных молекул. Один из распространенных методов лигирования включает использование липких концов, которые представляют собой одноцепочечные выступы, которые могут гибридизоваться с комплементарными последовательностями. В этой статье блога мы рассмотрим различные методы лигирования ДНК с использованием липких концов, а также приведем примеры кода, иллюстрирующие каждый подход.

Методы лигирования ДНК с липкими концами:

1. Традиционная ДНК-лигаза Т4:
   ДНК-лигаза Т4 — широко используемый фермент для лигирования ДНК. Он катализирует образование фосфодиэфирных связей между 5′-фосфатным и 3′-гидроксильным концами фрагментов ДНК. Вот пример фрагмента кода с использованием ДНК-лигазы Т4:

from Bio import SeqIO
from Bio.Seq import Seq
from Bio.Alphabet import generic_dna
from Bio.Restriction import *
fragment1 = Seq("AGCT", generic_dna)
fragment2 = Seq("GCTA", generic_dna)
ligation_product = fragment1 + fragment2
print(ligation_product)

1. Сборка Гибсона:
   Сборка Гибсона — это мощный метод лигирования ДНК, не требующий ферментов ДНК-лигазы. Он использует способность ферментов экзонуклеазы и ДНК-полимеразы создавать перекрывающиеся концы для последующего отжига и удлинения. Вот пример фрагмента кода для Gibson Assembly:

from Bio import SeqIO
from Bio.Seq import Seq
from Bio.Alphabet import generic_dna
fragment1 = Seq("AGCT", generic_dna)
fragment2 = Seq("GCTA", generic_dna)
ligation_product = fragment1 + fragment2
print(ligation_product)

1. Сборка Golden Gate:
   Сборка Golden Gate — это метод лигирования ДНК, в котором для создания липких концов используются ферменты рестрикции типа IIS. Эти ферменты расщепляют ДНК за пределами сайтов узнавания, образуя сплоченные концы, которые можно лигировать вместе. Вот пример фрагмента кода для сборки Golden Gate:

from Bio import SeqIO
from Bio.Seq import Seq
from Bio.Alphabet import generic_dna
from Bio.Restriction import *
fragment1 = Seq("AGCT", generic_dna)
fragment2 = Seq("GCTA", generic_dna)
enzyme = EcoRI
cut_fragment1 = enzyme.site + fragment1
cut_fragment2 = enzyme.site + fragment2
ligation_product = cut_fragment1 + cut_fragment2
print(ligation_product)

1. ПОЛЬЗОВАТЕЛЬСКОЕ клонирование:
   ПОЛЬЗОВАТЕЛЬСКОЕ клонирование (урацил-специфический реагент для вырезания) — это метод, который включает использование ПОЛЬЗОВАТЕЛЬСКИХ ферментов для создания липких концов во фрагментах ДНК. Фермент USER распознает и расщепляет остатки урацила, образуя когезивные концы для лигирования. Вот пример фрагмента кода для клонирования ПОЛЬЗОВАТЕЛЕЙ:

from Bio import SeqIO
from Bio.Seq import Seq
from Bio.Alphabet import generic_dna
fragment1 = Seq("AGCT", generic_dna)
fragment2 = Seq("GCTA", generic_dna)
ligation_product = fragment1 + fragment2
print(ligation_product)

Лигирование ДНК липкими концами — универсальный метод, позволяющий эффективно соединять фрагменты ДНК. В этой статье мы исследовали несколько методов лигирования ДНК с использованием липких концов, включая традиционные подходы на основе лигазы, такие как ДНК-лигаза Т4, а также новые методы, такие как сборка Гибсона, сборка Golden Gate и USER-клонирование. Понимая эти методы и имея под рукой примеры кода, вы сможете с уверенностью проводить эксперименты по лигированию ДНК и продвигать свои исследования в области молекулярной биологии.